1915年下半年，马叙伦兼任北京大学文科教授，开讲“宋学”、“老子”、“庄子”，其后又有《老子校诂》、《庄子义证》等多种著述出版，在国内外学术界均产生了较大的影响。
正当他潜心致力于教学和学术研究时，五四运动爆发了。1919年5月4日，北京学生为反对军阀政府在巴黎和会签订丧权辱国的条约，在天安门广场集会，马叙伦任教的北京大学走在运动的前列。学生们高呼“外争国权，内惩国贼”、“取消二十一条” 等口号，要求政府“拒绝合约签字”，会后举行了游行示威。军阀政府拒不出面答复爱国学生的正义要求，反而殴打手无寸铁的学生。愤怒的学生火烧卖国贼曹汝霖的住宅赵家楼，遭到军阀政府的镇压，在其后的时间里，当局逮捕了爱国学生一百多人。
北大校长蔡元培同情爱国学生，反对卖国，反对当局对学生的镇压而又爱莫能助，遂提出辞呈，离京赴杭州。军阀政府的倒行逆施激怒了向有爱国民主精神的马叙伦，他愤然放下书卷纸笔，积极投身爱国民主运动。蔡元培离校的当晚，北京大学教职员为挽留蔡元培和支持学生的爱国斗争，举行了全体会议，一致推举康宝忠、马叙伦、马寅初、李守常（大钊）等为代表到教育部请愿。教职员代表表示：不留任蔡校长，北大教职员即“一致总辞职”！
为了取得斗争的胜利，马叙伦吸取以往与反动派斗争的经验，与盟兄汤尔和商议组织起来，协调行动，以壮大声势。5月11日，北京中等以上学校成立教职员联合会，推选康宝忠为主席，马叙伦为书记（后康宝忠病逝，马叙伦兼任北大教职员会和北京教职员联合会主席）。
6月4日，受全校师生的重托，北大数十名教员前往北大三院（法学院）慰问被捕的爱国学生。文学院刘半农、周作人等教授在门前受到军警阻挠，马叙伦等人再次探望也遭到无理拒绝。后来，汇文大学一名美籍教授冲入了大门，军警竟未阻拦，马叙伦也随即冲入。两人来到了学生中间，师生相见格外激动。学生们置个人安危于不顾、一心报国的精神使马叙伦产生了共鸣。当他向学生介绍校外斗争情况时，却受到军警的阻止。马叙伦珍惜这难得的机会，便机智地用文言讲起来。
他从容地介绍外边的斗争形势，鼓励学生坚持斗争。被囚禁的学生不光看到了多日不见的师长，还获取了坚持斗争的力量。他们异常兴奋，齐声高呼，热烈鼓掌。反动军警站在一旁，不明就里，目瞪口呆。马叙伦不负重托，圆满地完成了慰问学生的任务。
几天后，学生们高呼“学界万岁”、 “北京大学万岁”的口号跨出改作牢房的北大三院；曹汝霖、章宗祥、陆宗舆三个亲日派要员“辞职”照准。这期间北京学生的爱国民主运动又得到了社会的广泛支持，上海、天津、南京、杭州、武汉、九江，以及山东、安徽等省的工人、学生、市民纷纷举行罢工、罢课、罢市。反动军阀北京政府被迫拒绝在“凡尔赛和约”上签字，爱国民主运动终于取得了重大胜利。
马叙伦等北大教授利用这个时机，于6月24日致电浙江省教育厅转蔡元培先生，再次恳请其收回辞职申请。马叙伦本人还单独致信，敦劝蔡元培返京出任北大校长，措词恳切，言之入理。又写信给在杭州的盟兄汤尔和，嘱其面见蔡元培，再陈北大师生挽留之意。马叙伦为北京大学的办学和发展倾尽了全力。
在学潮高涨的日子里，马叙伦夙兴夜寐，每日坚守在北大一院，协调校内外的爱国民主运动同时处理日常工作。在蔡元培辞职期间，实际上是他代理了北大的校务。一天，叙伦回家已经很晚，又接到电话请他开会。他赶到学校，才知道有人在征集“北大迁往上海”的签名，理由是：北京反动黑暗，对民主力量多有压制，迁往上海租界，不受政府控制。已有几名教员、学生签名，其中有傅斯年、罗家伦等人。胡适也支持迁校主张。几位文科教授不同意，认为迁校事关重大，总需教员评议会讨论商量才是。马叙伦不同意迁校，明确表示：“我们不是要奋斗？奋斗是要在黑暗里的。”马叙伦以教职员联合会书记的身份明确表态，他的观点，得到了全校师生的广泛赞同。
8月9日，蔡元培在给马叙伦的一封信中，高度肯定了他在自己辞职期间为北大所做的工作。蔡元培写道：“夷初先生左右，五四以后承公苦心维持，北大得以保存，众口同声，弟闻之不胜钦敬。奉前月二十八日惠书，恳切周详，令人感泣。迟迟未报，歉仄万分。既不能与北大脱离关系，本宜如来示所揭，早日北行。惟胃病未痊，尚不堪车马之劳……因而北行之期不能不稍缓……”在马叙伦和全校师生的殷切期望和努力下，蔡元培于1919年9月病愈后返回北大，再次出任校长。
在五四运动中，马叙伦走出书斋，和北大师生，和全市大中学校师生一起度过了斗争的日日夜夜。在蔡元培离校南下期间，他辛勤维持，联络北京各大、中学校；坚持原则，团结进步教授；果敢机智，不惧反动派压力，受到全校师生的一致拥护和尊敬。
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